如何保養(yǎng)和使用HPLC柱
發(fā)布日期：2014-07-08
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在使用過(guò)程中色譜柱的柱效不斷下降，N不斷減小，色譜峰越來(lái)越不對(duì)稱，形成嚴(yán)重拖尾峰，柱壓也在不斷升高。這一切的最魁禍?zhǔn)拙褪翘盍衔⒘５男螤畎l(fā)生了改變。
填料自身的溶蝕，改變微粒間的堆砌形狀，形成塌陷；變得不規(guī)則，越來(lái)越小；流動(dòng)相和樣品物質(zhì)逐漸被子微粒吸附，阻塞了微粒間的孔道，變的也越來(lái)越小。所以引起壓力明顯升高。
柱填料的改變必然引起柱頭形狀的改變，從而引起色譜峰形的改變。
一根色譜柱可能分析數(shù)千個(gè)樣品后性能仍然良好，也可能分析數(shù)個(gè)樣品后就不行了，有眾多因素影響色譜柱的壽命。所以要正確使用色譜柱，注意以下5個(gè)方面。
第一，加保護(hù)柱
保護(hù)柱是短柱，不超過(guò)3cm，加在分析柱前。要求保護(hù)柱的內(nèi)徑與分析柱的內(nèi)徑相同，兩柱填裝的填料也相同。如分析住使用C18鍵合相填料，保護(hù)柱也用鍵合相填料，但保護(hù)柱填料的粒度比較大。分析柱常用5um的填料，保護(hù)柱一般用10—20um的填料以減少壓力的增加。
保護(hù)柱中的填料的化學(xué)成分可以預(yù)飽和流動(dòng)相，減少分析柱中同種填料的溶蝕；保護(hù)柱收集流動(dòng)和樣品中垃圾，減少分析柱的污染與阻塞。
加了保護(hù)柱增加系統(tǒng)壓力，增寬了色譜峰的寬度，使用恰當(dāng)可以避免這些不得因素。
分析50～100個(gè)樣品可能就要新保護(hù)柱了。如果樣呂“臟”可能換得更勤。商品保護(hù)柱由柱套和柱芯組成，只要換上新柱芯就行了。換下的舊柱芯要扔掉，防止再用。
第二，避免高壓沖擊
色譜柱經(jīng)得起高壓，但經(jīng)不起突然變化的高壓沖擊。進(jìn)樣閥的轉(zhuǎn)動(dòng)緩慢，泵啟動(dòng)快，多柱間的切換都引起突然的高壓，對(duì)色譜柱的柱床和色譜柱的配件會(huì)產(chǎn)生損壞。
轉(zhuǎn)動(dòng)六通進(jìn)樣閥從“裝樣”到“進(jìn)樣”的蹭瞬時(shí)切斷流動(dòng)相的流動(dòng)，在閥的泵側(cè)壓力升高，在閥的柱側(cè)壓力降低轉(zhuǎn)到位后一個(gè)壓力沖擊。前面已婚介紹在進(jìn)樣器的泵到柱之間安裝壓力旁路支管可以緩解壓力沖擊，但支管的流速受到限制，要求轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)樣閥的動(dòng)作要快。
泵的啟動(dòng)不應(yīng)太快。如選用3mL/min的流量極要一下子開(kāi)到3mL/min,先1mL/min，再到2mL/min，然后3mL/min，每個(gè)改動(dòng)的間隔大于30s
第三，選用溫和的色譜條件。
多數(shù)色譜柱有很寬的實(shí)驗(yàn)條件范圍，但在具有使用中諸多條件疊加在一起，如pH、溫度、流動(dòng)相種類等，使受到限制。
以硅膠為載體的鍵合相填料要求使用的流動(dòng)相pH值在2.5～7.5之間，低于pH2的流動(dòng)相可能在載體硅膠和鍵合的硅烷之間發(fā)生水解反應(yīng)，使烷鏈掉下來(lái)；高于pH7的流動(dòng)相可能溶蝕載體硅膠。結(jié)果非堿性組分的保留不斷減少，堿性組分的保留增加，峰變寬。
已有鍵合相填料的新產(chǎn)品可在pH14的流動(dòng)相中使用。
以硅膠和以硅膠為載體的鍵合相填料、陰離子交換填料的色譜柱超過(guò)60℃后，會(huì)增加對(duì)流動(dòng)相中化學(xué)物質(zhì)的吸附。高溫下會(huì)引起小顆粒填料柱柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。40℃以上使用3um填料，70℃以上使用5um填料柱，會(huì)使N降低50%。
HPLC柱的使用柱溫要求恒定，要求加色譜柱恒溫箱，不要讓色譜柱放在裸露的自然環(huán)境中，下面以實(shí)驗(yàn)例說(shuō)明柱溫對(duì)色譜分離的重要性。
①柱溫對(duì)色譜峰形的影響 均勻恒定的柱溫使色譜峰形對(duì)稱，狹窄，杯拖尾。色譜柱溫不均勻使色譜峰形變寬、拖尾。
②柱溫對(duì)保留的影響 用75℃和54℃兩種柱溫和相同的色譜條件分離同一種樣呂，最后一個(gè)色譜峰的保留時(shí)間分別為10min和13min，54℃柱溫的tR增加了26%，在約1℃增加tR1%～3%。如果柱溫處在室溫下，按上面的推算，晴天（25°）某組分tR為15min，陰天（21°），氣溫下降4℃，取折中（1℃增加tR2%），某組分tR為16min10s，保留時(shí)間增加了1min10s.
③柱溫對(duì)色譜峰選擇性的影響 從75還發(fā)現(xiàn)柱溫54℃時(shí)；峰2（硝基乙烷）tR為120s，峰3（m-鄰苯二甲酸）tR為2min45s，峰5（4-氯丁烷）tR為4min25s，峰6（3-氰基苯甲酸）tR為6min50s。柱溫75℃時(shí)：峰2tR為1min40s，峰3tR為1min55s，兩峰的Rs變差；6tR為4min20s，峰5tR為4min40s，兩峰的Rs變差，與柱溫54℃相比，峰位也發(fā)生了改變，峰5（4-氯丁烷）跑到峰6（3-氰基苯甲酸）后面了。
④流動(dòng)相溫度與柱溫不一致對(duì)分離的影響 現(xiàn)在已普遍使用色譜柱的恒溫裝置，但會(huì)忽略保持流動(dòng)相溫度與譜柱溫度的一致。
第四，凈化樣品
凈化樣品的概念不同于樣品預(yù)處理，意指HPLC樣品通過(guò)預(yù)處理等程序后，在進(jìn)樣前還要凈化樣品。用特指的溶劑或流動(dòng)相溶解、稀釋色譜樣品，多數(shù)化學(xué)物質(zhì)（包括要分離的組分）都能溶解成澄明的樣品溶液，進(jìn)入色譜柱后還會(huì)流出來(lái)，不會(huì)對(duì)色譜柱造成危害。如果樣品含有固體顆粒沉淀，樣品渾濁不透明，樣品中有絮狀物，這種“臟”樣品中的顆粒會(huì)磨損六通進(jìn)樣閥中的轉(zhuǎn)子，導(dǎo)通轉(zhuǎn)子上的三個(gè)導(dǎo)槽。在六通進(jìn)樣器分曾通過(guò)。
“臟”樣品對(duì)色譜柱的分離效能和色譜柱壽命影響也很大工業(yè)，有些物質(zhì)不可逆地吸附在填料表面上會(huì)增加柱壓，降低柱效，色譜峰形變差、變壞，改變組分的保留參數(shù)。即使在分析柱前加了保護(hù)柱，而“臟”樣品會(huì)使保護(hù)柱很快阻塞，系統(tǒng)壓力很快升高。
用針頭過(guò)濾器過(guò)濾樣呂可以濾除樣品中90%以上的雜質(zhì)，能有效地保護(hù)進(jìn)樣閥和色譜柱。針頭進(jìn)樣器如：兩片帶管子的塑料圓盤中間緊壓一層過(guò)濾膜，過(guò)濾膜孔＜5um。用前選用進(jìn)樣針筒吸水沖洗針頭過(guò)濾器，然后用甲醇，再用流動(dòng)相沖洗，最后用進(jìn)樣針筒吸取樣品后通過(guò)針頭過(guò)濾器過(guò)濾樣品準(zhǔn)備進(jìn)樣。
第五，用后沖洗色譜柱和整個(gè)HPLC系統(tǒng)。
每次工作結(jié)束后用強(qiáng)溶劑沖洗柱和色譜系統(tǒng)是一個(gè)良好的習(xí)慣。用正相色譜法分析樣品后可用配制原流動(dòng)相的主要試劑（去掉酸、堿、離子化合物等到）加5%甲醇沖洗。例如分析用的原流動(dòng)相為正已烷三氯甲烷-氯水（體積比為：98：1.6:0.5),沖沖洗中去掉0.5%的氨水，加進(jìn)5%的甲醇。不含有氨的下已烷-三氯甲烷沖洗液，因“記憶”效應(yīng)很快帶走色譜柱和色譜系統(tǒng)中的氨。強(qiáng)溶劑甲醇能有效地沖去留在柱上的強(qiáng)吸附成分。
同樣，用反相色譜法分析樣呂后用去掉酸、堿、鹽的配制原流動(dòng)相的主要度劉作為沖洗液。如分析用的原流動(dòng)相為水-甲醇-磷酸鹽緩沖液（40：60：0.01），就用水-甲醇（40：60）做沖洗液，很快去除系統(tǒng)中的磷酸鹽，最后改用水-甲醇（90：10）沖洗。
沖洗過(guò)的色譜柱和色譜系統(tǒng)不會(huì)因鹽類析出晶體阻塞管道、接頭，污染檢測(cè)器池窗，也不會(huì)因分析生物樣品后蛋白質(zhì)等沉淀被柱吸附，降低分離效能，也防止色譜系統(tǒng)內(nèi)霉菌和藻類繁殖、生長(zhǎng)。
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